En 1958 ingresó en el Banco Santander desempeñando diversos cargos, siendo nombrado en 1964 director general, y más tarde, en 1986, presidente. A partir de ese momento comenzó un estilo de gestión muy personal, arriesgado y revolucionario en la banca española, llevando al Banco Santander a ser el primer banco de España. Por ejemplo, en 1989 el Santander rompió los pactos entre bancos españoles sobre el interés aplicable a las cuentas de ahorro que restringían la competencia en 1989 al presentar un producto de alta rentabilidad.
Además, el Banco de Santander emprendió una política de expansión, dentro y fuera de España, no consensuada con los directivos de otras entidades. Estableció alianzas con la Banca Champalimaud de Portugal, la Société Générale de Francia, The Royal Bank of Scotland del Reino Unido (aunque acabó vendiendo su participación en 2005), el Commerzbank de Alemania, el San Paolo de Italia y el BCM de Marruecos. Ha invertido también ampliamente en América, comprando bancos en Argentina, Chile, Colombia, Brasil, Perú, Venezuela y México. También llegó a ser el principal accionista del First Fidelity estadounidense, pero vendió su participación tras la fusión con el First Union.
En 1994 el Banco de Santander adquirió el Banesto, que entonces era el cuarto banco español, en subasta pública. Unas confusas operaciones de cesión de créditos del Santander al Banesto sin practicar las debidas retenciones de impuestos, llevaron a la Fiscalía Anti-Corrupción a investigar al banco y a imputar un delito fiscal a Botín.
A partir de 1998 se iniciaron los contactos entre el Banco Santander y el Banco Central Hispano para fusionarse, culminando en 1999 con la creación de uno de los bancos más importantes de España y Europa, el Banco Santander Central Hispano.
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